数字PCR测定病原体载量绝对定量验证试验

检测项目

绝对定量性能验证：

• 病原体拷贝数测定：靶基因绝对定量值（copies/μL）、与数字PCR理论值偏差（±5%）
• 动态范围覆盖：高浓度样本（1×10^6copies/μL）至低浓度样本（1×10^1copies/μL）的检测覆盖度

线性范围测试：

• 线性相关性：靶基因浓度对数与检测信号（阳性微反应单元数）的线性回归系数（R²≥0.99）
• 线性偏差：各浓度点测量值与理论值的相对误差（≤10%）

检测限确定：

• 最低检测限（LOD）：95%置信水平下可检测到的最低病原体浓度（≤10copies/μL）
• 定量限（LOQ）：变异系数（CV）≤20%的最低可准确定量浓度（≤20copies/μL）

重复性试验：

• intra-批重复性：同一批次样本重复检测6次的拷贝数变异系数（CV≤5%）
• inter-批重复性：不同批次试剂检测同一样本的拷贝数变异系数（CV≤8%）

准确性验证：

• 标准物质回收：已知浓度标准品的检测值与理论值的相对偏差（≤15%）
• 对比试验：与qPCR检测结果的相关性（R²≥0.98）、绝对偏差（≤0.5log10copies/μL）

抗干扰能力测试：

• 血红蛋白干扰：添加10g/L血红蛋白样本的拷贝数回收率（80%-120%）
• 甘油三酯干扰：添加5mmol/L甘油三酯样本的拷贝数变异系数（CV≤10%）

样本基质效应测试：

• 血清基质：血清样本中病原体拷贝数回收率（90%-110%）
• 唾液基质：唾液样本中病原体拷贝数偏差（±0.1log10copies/μL）
• 粪便基质：粪便样本中抑制剂（如腐殖酸）对检测结果的影响（CV≤15%）

仪器精密度验证：

• 微反应单元分割均匀性：每个芯片的微滴数量（≥10000个）、微滴大小变异系数（CV≤3%）
• 荧光信号检测精度：阳性微滴荧光强度阈值（≥3倍背景信号）、信号分辨率（≤0.1RFU）

试剂稳定性考察：

• 储存稳定性：4℃储存30天试剂的扩增效率（≥95%）、检测限变化（≤10%）
• 运输稳定性：模拟运输条件（4-25℃，72小时）后试剂的拷贝数偏差（±0.2log10copies/μL）

不同批次一致性验证：

• 批次间偏差：3个不同批次试剂检测同一标准品的拷贝数变异系数（CV≤6%）
• 批次内均匀性：同一批次试剂不同管间的扩增曲线一致性（阈值循环差≤1.0cycle）

检测范围

1.临床血清样本：涵盖乙肝病毒（HJianCe）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等病原体感染患者血清，重点检测低载量样本（<100copies/μL）的绝对定量准确性

2.呼吸道分泌物：包括新冠病毒（SARS-CoV-2）、流感病毒（InfluenzaA/B）等病原体的咽拭子、鼻拭子样本，侧重样本中黏液、细胞碎片对检测结果的影响

3.粪便样本：针对肠道病原体（如轮状病毒、诺如病毒、志贺菌）的粪便悬液，重点测试腐殖酸、胆红素等抑制剂的抗干扰能力

4.血液制品：包括血浆、血小板浓缩物等血液制品，重点检测潜在病原体（如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EJianCe））的残留量（≤10copies/μL）

5.脑脊液样本：针对中枢神经系统感染病原体（如脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌）的脑脊液，侧重低体积样本（≤100μL）的检测灵敏度

6.尿液样本：包括泌尿系统感染病原体（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌）的尿液样本，重点测试尿液中尿素、肌酐等成分对扩增反应的影响

7.组织匀浆：涵盖肿瘤组织（如宫颈癌组织中的人乳头瘤病毒（HPV））、肝组织（如HJianCe共价闭合环状DNA（cccDNA）），重点检测组织中病原体的细胞内载量（copies/10^6细胞）

8.环境样本：包括污水、食品样本（如生鲜农产品表面的沙门氏菌、李斯特菌），侧重样本中大量背景微生物对目标病原体检测的干扰

9.疫苗生产中间产物：针对疫苗生产过程中的病毒种子批（如新冠病毒灭活疫苗中间产物），重点检测病毒颗粒数（copies/mL）的绝对定量准确性

10.动物源性样本：包括猪瘟病毒（CSFV）、禽流感病毒（AIV）等动物病原体的血清、组织样本，侧重跨物种病原体检测的方法适用性

检测方法

国际标准：

• ISO20813:2019分子生物标志物分析数字PCR方法通则
• ASTME2664-21数字PCR检测微生物病原体的标准指南
• CLSIEP17-A2:2012定量检测方法检测限和定量限的确定

国家标准：

• GB/T38576-2020数字PCR检测方法通则
• GB/T22576.1-2008医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求
• WS/T699-2020新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南

ISO20813:2019与GB/T38576-2020均规定了数字PCR的基本操作流程，但ISO标准更侧重微反应单元的分割均匀性要求（变异系数≤5%），而GB标准增加了对中国常见病原体（如HJianCe、HCV）的具体检测参数（如LOD≤5copies/μL）；ASTME2664-21强调了微生物病原体检测中的样本前处理方法（如核酸提取效率≥80%），而CLSIEP17-A2则详细规定了检测限和定量限的统计计算方法（如采用Probit回归分析）；WS/T699-2020针对新冠病毒检测，明确了样本类型（咽拭子、鼻拭子）及核酸提取试剂的选择要求（如磁珠法提取效率≥95%）。

检测设备

1.数字PCR仪：Bio-RadQX200DropletDigitalPCRSystem（微滴生成量：1-2million个/样本，荧光通道：FAM、VIC、Cy5）

2.核酸提取仪：ThermoFisherKingFisherDuoPrime（提取效率：≥90%，处理体积：20-1000μL）

3.荧光定量PCR仪：AppliedBiosystems7500FastDx（荧光通道：FAM、TAMRA、ROX，用于对比试验）

4.超微量分光光度计：NanoDropOneC（核酸浓度检测范围：2-1500ng/μL，吸光度比值A260/A280：1.8-2.0）

5.台式高速离心机：Eppendorf5424R（最大转速：21000×g，温度范围：4-37℃）

6.生物安全柜：ESCOA2型（洁净等级：ISO5级，风速：0.5m/s）

7.恒温水浴锅：HeraeusWB2000（温度范围：37-100℃，精度：±0.5℃）

8.移液器：EppendorfResearchPlus（量程：0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL，精度：±0.5%-1.0%）

9.-80℃超低温冰箱：HaierDW-86L580（温度范围：-86--60℃，容量：580L）

10.涡旋混合器：Vortex-Genie2（转速：100-3200rpm，震荡方式：连续/脉冲）

11.微孔板reader：TecanInfiniteM200Pro（荧光检测范围：380-700nm，灵敏度：≤1fmol/LFAM）

12.纯水机：MilliporeMilli-QIQ7000（电阻率：18.2MΩ·cm，总有机碳：≤5ppb）

13.高压灭菌器：SanyoMLS-3750（温度：121℃，压力：103kPa，灭菌时间：20min）

14.电子天平：MettlerToledoXS205（量程：0-210g，精度：0.01mg）

15.PCR仪：Bio-RadC1000Touch（热循环温度范围：4-99℃，升温速率：5℃/s）

北京中科光析科学技术研究所【简称：中析研究所】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

注意:因业务调整,暂不接受个人委托测试,望谅解(高校、研究所等性质的个人除外).

CMA/CNAS等证书详情，因时间等不可抗拒因素会发生变更，请咨询在线工程师.

合作客户(部分)

1、自创办以来和政、企、军多方多次合作，并获得众多好评；

2、始终以"助力科学进步、推动社会发展"作为研究院纲领；

3、坚持科学发展道路，统筹实验建设与技术人才培养共同发展；

4、学习贯彻人大精神，努力发展自身科技实力。