新冠病毒RT-PCR扩增效率测定

检测项目

1.扩增效率测定：目标效率90-110%，允许偏差±5%，基于标准曲线斜率计算。

2.标准曲线斜率：理想值-3.3to-3.6，反映每循环扩增倍数，单位log10。

3.决定系数R²：要求≥0.99，表示标准曲线线性度，偏差容忍±0.01。

4.检测限（LOD）：最低可检测浓度10copies/μL，置信水平95%，重复测试3次。

5.定量限（LOQ）：可靠定量浓度100copies/μL，精密度CV≤20%，基于5次重复。

6.特异性验证：无交叉反应，验证与非目标序列如人类基因组或其他病毒，使用BLAST分析。

7.灵敏度测试：检测低浓度样本能力，效率保持90-110%，浓度梯度测试。

8.重复性测试：日内精密度CV≤5%，基于Ct值，3次独立实验。

9.再现性测试：日间精密度CV≤10%，不同操作员和设备，5次实验。

10.引物效率：单个引物扩增效率匹配目标序列，退火温度55-65°C。

11.探针效率：荧光探针报告和淬灭效率，荧光信号强度变化≤10%。

12.模板完整性：RNA质量A260/A280ratio1.8-2.0，RIN值≥7，基于电泳或芯片分析。

13.抑制物检测：内参基因扩增效率验证，Ct值偏移≤1cycle。

14.扩增线性范围：浓度梯度1E1to1E6copies/μL，R²≥0.98，斜率一致性。

检测范围

1.鼻咽拭子样本：常见临床采集方式，关注RNA提取效率和抑制剂如黏液影响。

2.唾液样本：非侵入性采集，检测灵敏度和特异性，可能含有口腔细菌干扰。

3.血液样本：用于血清学辅助检测，RNA浓度较低，需高灵敏度方法。

4.环境拭子样本：表面采样如门把手，可能含有灰尘或化学物质干扰。

5.废水样本：社区疫情监测，需要浓缩步骤和纯化，测试复杂基质影响。

6.动物组织样本：zoonotic传播研究，RNA完整性关键，需快速提取。

7.细胞培养物：病毒培养样本，高浓度RNA，验证扩增线性范围和效率。

8.临床血清样本：抗体检测配套，RNA提取挑战，可能含有血红蛋白抑制剂。

9.呼吸道分泌物：包括痰液，粘度高，需蛋白酶预处理，测试提取回收率。

10.冷冻保存样本：长期存储-80°C，测试RNA降解对扩增效率的影响。

11.快速检测卡样本：现场检测应用，效率验证简化，注重快速结果一致性。

12.高通量筛查样本：大规模检测如pooledtesting，注重通量和效率一致性。

13.干血斑样本：便于运输和存储，检测灵敏度可能降低，需优化提取。

14.空气采样器样本：气溶胶收集，低病毒载量，测试浓缩后扩增效率。

检测方法

国际标准：

ISO20395:2019Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR

ASTME2887-19JianCePracticeforQuantitativeReverseTranscriptionPCR

ISO15189:2012Medicallaboratories—Requirementsforqualityandcompetence

CLSIMM19-A2QuantitativeMolecularMethodsforInfectiousDiseases

ISO17025:2017Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories

ISO13485:2016Medicaldevices—Qualitymanagementsystems—Requirementsforregulatorypurposes

FDAGuidanceforIndustry:AnalyticalProceduresandMethodsValidationforDrugsandBiologics

WHOGuidelinesforEbolaandCOVID-19MolecularTesting

EMEANoteforGuidanceonValidationofAnalyticalProcedures

ICHQ2(R1)ValidationofAnalyticalProcedures:TextandMethodology

国家标准：

GB/T37871-2019医用分子生物学检测试剂盒通用要求

GB/T34796-2017定量聚合酶链反应（qPCR）检测方法通则

GB/T19438.1-2004禽流感病毒检测方法第1部分：通用要求

GB/T30989-2014逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法

GB/T37872-2019病原微生物核酸测定试剂盒性能评价通则

GB/T14926.50-2001实验动物微生物学检测方法

GB/T17592-2011医用实验室质量控制要求

GB/T27403-2008实验室质量控制规范分子生物学检测

GB/T39268-2020新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求

GB/T39729-2020核酸检测试剂盒性能验证通则

检测设备

1.实时荧光定量PCR仪：型号ABI7500Fast，功能：四通道荧光检测，温度梯度控制，升降温速率5°C/s。

2.分光光度计：型号NanoDropOne，功能：微量核酸浓度和纯度测量，波长范围190-850nm，样本量1-2μL。

3.高速离心机：型号Eppendorf5430R，功能：最大转速14500rpm，温度控制-10°Cto40°C，用于RNA提取。

4.电泳系统：型号Bio-RadMini-PROTEANTetra，功能：凝胶电泳验证PCR产物大小，电压范围10-300V。

5.自动化核酸提取仪：型号QiagenQIAcubeHT，功能：高通量样本处理，96孔板兼容，集成纯化步骤。

6.微孔板阅读器：型号TecanSpark，功能：多模式检测包括荧光、吸光度和发光，波长范围200-1000nm。

7.恒温混匀仪：型号EppendorfThermoMixerC，功能：温度控制范围-10°Cto100°C，振荡速度300-1400rpm。

8.超低温冰箱：型号ThermoScientificForma900Series，功能：-86°C存储容量700L，温度波动±5°C。

9.生物安全柜：型号NuAireNU-437-400，功能：ClassIITypeA2，风速0.5m/s，HEPA过滤。

10.数据分析工作站：配置高技术软件如SDSSoftwarev2.4，功能：扩增曲线分析、效率计算、统计验证。

北京中科光析科学技术研究所【简称：中析研究所】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

注意:因业务调整,暂不接受个人委托测试,望谅解(高校、研究所等性质的个人除外).

CMA/CNAS等证书详情，因时间等不可抗拒因素会发生变更，请咨询在线工程师.